酶產品的常見問題及解答

1.常用酶的標準底物以及相關代謝工具

酶	標準底物	肝微粒體	S9	Liver cytosol
CYP1A2	Phenacetin	+	+
CYP2B6	Bupropion	+	+
CYP2C8	Amodiaquine	+	+
CYP2C9	Diclofenac	+	+
CYP2C19	S-Mephenytoin	+	+
CYP2D6	Dextromethorphan	+	+
CYP2E1	Chlorzoxazone	+	+
Glutathione Transferase (GST)	1-chloro-2,4-dintrobenzene		+
Sulfurotrnasferase (SULT)	7-hydroxycoumarin		+	+
Uridine Glucuronide Transferase (UGT)	7-hydroxycoumarin	+	+
Aldehyde Oxidase	Phthalazine		+	+

“+”表示存在。“空白”表示微量或不存在。

2.貼壁肝細胞與懸浮肝細胞的區(qū)別？
答：貼壁細胞能夠在鋪了膠原的培養(yǎng)板上形成貼壁層，在換液操作時能夠保留在培養(yǎng)板的孔內。主要適用于需要多次換液，較長時間培養(yǎng)的試驗，如誘導，轉運體，HBV感染等。懸浮細胞是沒有貼壁能力的細胞，適合短時間實驗（小于5小時），如代謝穩(wěn)定性，代謝產物鑒定，肝細胞攝取等試驗。

3.肝細胞解凍操作步驟？
答：原代肝細胞在解凍時采取快融的策略。用鑷子等工具從液氮中拿出細胞后要首先在空氣中放置幾秒鐘讓液氮揮發(fā)，防止驟然升溫造成液氮噴出傷人或管壁裂開。再放入37°C中水浴約70-90秒，觀察到凍存管內的細胞將要化凍還沒有成為液體時停止水浴最佳。IVT原代貼壁肝細胞無需離心處理，直接加入到plating media鋪板即可。

4.該如何在肝細胞或微粒體中選擇體外代謝工具？
答：藥物通過肝細胞色素P450代謝是其主要的代謝途徑。微粒體含有全部CYP代謝酶能夠良好地預測體內代謝的情況，方便試驗與購買，是體外代謝研究的首選工具。肝細胞因其具有完全的細胞代謝功能，可以做微粒體代謝的補充。但是在做需要完全細胞生理功能的試驗（如誘導，轉運體等）時需要選擇肝細胞作為研究工具，是微粒體所不能替代的。

5.供體數(shù)和酶活不同的微粒體怎么選擇？
答：為消除試驗材料的個體差異，將多供體混合在一起。參考FDA指導原則，在相關性分析法研究藥物代謝表型時可以選擇10個不同的供體進行試驗，所以在一般的代謝或抑制試驗中可以選擇10個以上供體的微粒體均可進行研究。
另外，做代謝穩(wěn)定性（Stability）實驗以及代謝產物鑒定（MedID）實驗，推薦使用高酶活（H-class）的微粒體，做CYP450抑制實驗，建議用普通酶活的微粒體。

6.微粒體如何進行分裝保存？
答：微粒體一次實驗用不完需要分裝保存的，建議化凍時候不要稀釋，直接將原液在冰上進行分裝，將不用的部分寫好標簽凍存在-80°C冰箱中。

7.微粒體能凍融多少次？
答：微粒體一般凍融5次以內不影響質量。

8.重組酶有高活性和低活性的有什么區(qū)別？實驗時該如何選擇？
答：高活性的重組酶代謝速率較大，一般在較短的時間內（如10min）代謝速率與孵育時間成線性。低活性重組酶在較長時間內（如1h）具有良好的代謝速率與孵育時間成線性。低活性的重組酶更接近體內環(huán)境。

9.重組酶有+B5的，有不加b5的，有什么區(qū)別？
答：微粒體上天然水平的CYP 亞酶，在生理狀態(tài)下發(fā)生催化作用時伴隨生理水平的細胞色素b5，以及NADPH-CYP 還原酶的輔助。為模擬生理狀態(tài)，在克隆代謝酶亞基因時會考慮同時克隆細胞色素b5 和還原酶。這并不是發(fā)生催化反應的必需條件，且不影響實驗結論。

10.培養(yǎng)液保質期多久？加了抗生素以后？
答：培養(yǎng)液在4°C冰箱中可以放3個月。加入抗生素后貨架期為7天。

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11.FDA指導原則要求做哪些轉運體？試驗方案設計策略如何？
答：FDA指導原則規(guī)定的轉運體包含：腸外排ABC轉運體MDR1，BCRP，肝SLC轉運體OATP1B1，OATP1B3，以及腎SLC轉運體OAT1，OAT3和OCT2這7個轉運體。在試驗設計上轉運體的抑制試驗和底物試驗都需要進行研究。進行抑制試驗，以評估原研藥對已經上市的藥物的影響；進行底物研究以評估上市藥物對原研藥的影響?？蓛?yōu)先進行抑制試驗。

12.代謝表型中設計原則？亞酶貢獻度計算方法？
答：代謝表型研究目前主要有4中鑒定方法，即相關性分析法、化學抑制法、抗體抑制法和重組酶法。用化學抑制法和重組酶法相結合比較好的選擇。在化學法定性處參與代謝的亞酶后，用相應的重組酶進行驗證，并進行亞酶貢獻度計算。測定重組酶亞型對微粒體代謝候選藥物的貢獻率主要有重組酶豐度法、酶動力學法、單抗抑制法、相對活性因子（RAF法）和系統(tǒng)間外推因子法（ISEF），最得到公認的是RAF和ISEF法。

13.誘導實驗mRNA 與催化活性在誘導結論上不一致怎么辦？
答：mRNA是FDA指導原則（2012版）和CFDA指導原則（2014版）最新規(guī)定的檢測體外誘導實驗的指標，且在FDA指導原則中是唯一指標。目前階段應當以 mRNA 的數(shù)據(jù)做最后結論，催化活性指標作為重要參考。

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在做實驗之前，預先按照技術規(guī)范檢驗產品質量。在產品開始使用之后，買方對應用及其結果負有全部責任。若有質量異議，買方需在收到貨物后10個工作日內書面通知賣方，過期無效。

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